阳性克隆（阳性克隆的筛选与鉴定实验报告）

彩虹养生网精选：

• 1、阳性克隆的介绍
• 2、琼脂糖凝胶电泳如何判别是阳性克隆?
• 3、系统分析你掌握的几种重组阳性克隆子的筛选和鉴定方法
• 4、基因克隆有哪些步骤,如何筛选阳性克隆
• 5、如何进行重组DNA阳性克隆的鉴定
• 6、阳性克隆筛选方法及原理

阳性克隆的介绍

含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。

实验原理。经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间通常说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

蓝白筛选法：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。

筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长，而不含报告基因的大肠杆菌（就是转化失败的）就不能生长。这样过了两三天后，在培养基上看见的菌落就是阳性科隆。这一过程就是阳性科隆筛选。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因，链霉素抗性基因等等。

琼脂糖凝胶电泳如何判别是阳性克隆?

在进行PCR扩增时，通用引物与阳性克隆中的目的基因两侧的通用序列结合，形成引物-模板复合物。在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，按照模板序列合成新的DNA链。经过一定的循环次数，目的基因被大量扩增，通过凝胶电泳等方法可以检测到扩增产物，从而验证阳性克隆。

利用抗生素抗性基因进行筛选 2）通过α互补使菌产生颜色来筛选 3）利用报告基因筛选克隆子 （2）根据重组子结构特征的筛选法 1）琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小 2）限制性内切酶分析 3）印迹杂交方法 4）PCR法 （3）根据目的基因表达产物采用免疫化学方法筛选。

最后跑电泳，看在相应位置是否存在DNA带。

能够扩增出单一目标片段的样品最为模板，以检测反应体系是否成功。如果阳性对照也有杂带，则说明应该是在最开始扩增的时候，克隆之前就有杂带了，需要重新做一下。或者再把之前的单克隆划线，重新分单克隆纯化再做。当然，因为你给出的信息也很有限，只能先从这几个方面去考虑下。找找问题在哪。

而pcDNA1的酶切由于可能存在未完全切开的质粒（在后续转化中会形成大量的假阳性克隆），需要进行琼脂糖凝胶电泳，割取线性化的载体片段进行胶回收（图25）。然后将PVT1和pcDNA1酶切片段使用DNA连接酶进行连接，转化。同样，使用菌落PCR和Sanger测序进行阳性克隆子pcDNA1-PVT1的筛选（图26）。

系统分析你掌握的几种重组阳性克隆子的筛选和鉴定方法

1、利用抗生素抗性基因进行筛选 2）通过α互补使菌产生颜色来筛选 3）利用报告基因筛选克隆子 （2）根据重组子结构特征的筛选法 1）琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小 2）限制性内切酶分析 3）印迹杂交方法 4）PCR法 （3）根据目的基因表达产物采用免疫化学方法筛选。

2、然后，对重组子进行筛选与鉴定。由于转化实验中会产生大量的非重组子和假阳性克隆，因此需要通过筛选和鉴定来获取真正的阳性克隆。常用的筛选方法包括抗生素抗性筛选、分子杂交筛选等。鉴定方法则包括PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定等。最后，对重组载体进行扩增和纯化。

3、常见方法有：有限稀释法和软琼脂克隆技术 有限稀释法：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞。 软琼脂克隆技术：从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，一适当浓度杂交瘤细胞加入到软琼脂培养基中，形成有一个细胞增殖来的细胞集群。

4、一．细胞方法 将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。

5、③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

基因克隆有哪些步骤,如何筛选阳性克隆

PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

例如我们常见的识别回文序列的内切酶， Eco R I，属于Type IIP类型，这种酶的切割位点在识别位点内部；而像现在在CRISPR/Cas9相关基因克隆中用到的 Bpi I等酶，则属于Type IIS型，它的切割位点离识别位点有几个到几十个碱基的距离。

蓝白筛选法：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。

PCR扩增克隆法 PCR扩增克隆法是在已知植物基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库（genebank）中找到有关基因序列，据此合成一对寡聚核苷酸引物，从植物中提取染色体DNA或RNA，进行PCR扩增。

通过病毒法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

如何进行重组DNA阳性克隆的鉴定

1、第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

2、利用抗生素抗性基因进行筛选 2）通过α互补使菌产生颜色来筛选 3）利用报告基因筛选克隆子 （2）根据重组子结构特征的筛选法 1）琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小 2）限制性内切酶分析 3）印迹杂交方法 4）PCR法 （3）根据目的基因表达产物采用免疫化学方法筛选。

3、蓝白筛选法：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。

4、通用引物验证阳性克隆的方法通常涉及PCR技术。PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，通过DNA复制在体外扩增特定的DNA片段。在验证阳性克隆时，通用引物被设计用来与克隆载体上的通用序列结合，从而扩增出插入片段。这种方法可以快速、准确地鉴定出含有目的基因的阳性克隆。

阳性克隆筛选方法及原理

蓝白筛选法：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。

筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

所以要同时导入一个报告基因（目的基因和报告基因位于同一个载体上）。导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长，而不含报告基因的大肠杆菌（就是转化失败的）就不能生长。这样过了两三天后，在培养基上看见的菌落就是阳性科隆。这一过程就是阳性科隆筛选。

另一种方法是使用套环，将套环固定在阳性克隆周围，然后在套环内加入胰蛋白酶或EDTA进行消化。消化完成后的物质会被吸收到新的培养孔中进行培养。最后，通过有限稀释法，将这些阳性克隆分散到96孔板中进行精确筛选，确保每个孔只含有单一的阳性克隆。

根据重组子遗传重组表型改变的筛选法 1）利用抗生素抗性基因进行筛选 2）通过α互补使菌产生颜色来筛选 3）利用报告基因筛选克隆子 （2）根据重组子结构特征的筛选法 1）琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小 2）限制性内切酶分析 3）印迹杂交方法 4）PCR法 （3）根据目的基因表达产物采用免疫化学方法筛选。